Padronização e avaliação da técnica de genotipagem in house a partir de amostras de sangue aplicadas em papel de filtro: identificação de subtipos de HIV-1 e de mutações associadas à diminuição da susceptibilidade aos antirretrovirais

Jesus, Carlos Silva de

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Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS)
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Medicina
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MEDI - Dissertações de Mestrado
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dc.contributor.advisor	Silva, Walter de Araújo Eyer
dc.contributor.author	Jesus, Carlos Silva de
dc.date.accessioned	2018-12-05T19:44:55Z
dc.date.available	2018-12-05T19:44:55Z
dc.date.issued	2017-09-05
dc.identifier.citation	JESUS, Carlos Silva de. Padronização e avaliação da técnica de genotipagem in house a partir de amostras de sangue aplicadas em papel de filtro: identificação de subtipos de HIV-1 e de mutações associadas à diminuição da susceptibilidade aos antirretrovirais. 2017. 122 f. Dissertação (Mestrado em Infecção HIV/AIDS e Hepatites Virais) - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.	pt_BR
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/unirio/12614
dc.description.sponsorship	n/a	pt_BR
dc.language.iso	Portuguese	pt_BR
dc.rights	openAccess	pt_BR
dc.title	Padronização e avaliação da técnica de genotipagem in house a partir de amostras de sangue aplicadas em papel de filtro: identificação de subtipos de HIV-1 e de mutações associadas à diminuição da susceptibilidade aos antirretrovirais	pt_BR
dc.title.alternative	Standardization and evaluation of the in-house genotyping technique from blood samples applied on filter paper: identification of HIV-1 subtypes and mutations associated with decreased susceptibility to antiretrovirals	pt_BR
dc.type	masterThesis	pt_BR
dc.contributor.advisor-co	Fernandez, José Carlos Couto
dc.contributor.referee	Silva, Walter de Araújo Eyer
dc.contributor.referee	Ribeiro, Luiz Claudio Pereira
dc.contributor.referee	Bullosa, Lídia Theodoro
dc.contributor.referee	Souza, Fabiana Barbosa Assumpção de
dc.contributor.referee	Junior, Ivan Neves
dc.degree.department	CCBS	pt_BR
dc.degree.grantor	Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO	pt_BR
dc.degree.level	Mestrado Profissional	pt_BR
dc.degree.local	Rio de Janeiro, RJ	pt_BR
dc.degree.program	Programa de Pós-Graduação em Infecção HIV/AIDS e Hepatites Virais	pt_BR
dc.subject.cnpq	CIÊNCIAS DA SAÚDE	pt_BR
dc.subject.cnpq	MEDICINA	pt_BR
dc.subject.cnpq	DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS	pt_BR
dc.subject.en	DBS – dry blood spots	pt_BR
dc.subject.en	HIV-1	pt_BR
dc.subject.en	Genotyping	pt_BR
dc.description.abstracten	HIV-1 drug resistance tests (HIVDR) are important tools in the clinical treatment of HIV-1 infected patients in antiretroviral therapy (ARTc) and surveillance of drug-resistant variants at population levels. Normally this test is performed using plasma samples, which require cold transport to be transported from distant collection sites to laboratories, but recently have been used whole blood samples applied on dry blood filter paper (DBS) , which is an alternative form of collection that does not require the cold chain and which can be transported and maintained within a period of up to 14 days at room temperature and is a convenient alternative to plasma for antiretroviral resistance testing at resources. The aim of the present study was to compare the results obtained from the HIV-1 in-house genotyping test using plasma, considered the gold standard, with those obtained through DBS samples. The correlation between the resistance results generated from DBS and plasma was investigated. A total of 102 samples were collected for the study. Twenty-six samples were excluded because the viral load was less than 1,000 copies/mL and 76 samples were sequenced for resistance to HAART in plasma samples, including specimens from patients being treated (n = 62) and naïve (n = = 14). DBS samples were prepared using 100μL of whole blood and stored with desiccant at -70 ° C. Among the 76 samples whose viral variants obtained from plasma that were sequenced, it was possible to obtain the amplification and sequencing of 42 samples applied in DBS that had a plasma viral load higher than 3,000 copies/mL. For the extraction of viral RNA, two different techniques were used, through the NucliSENS ® miniMag ® system, with low yield (13/57 - 22.8%), and with QIAamp viral RNA minikit, which presented yield (33/51 - 64.7%) of extracted RNA comparable to plasma samples. There was 100% concordance in determining the genetic subtype and 97.7% success in comparing the mutations found between the two matrices. It has been demonstrated that there is a high concordance between the results of sequencing from plasma and DBS samples, both for viral subtype identification and for the determination of mutations associated with decreased antiretroviral susceptibility. These results indicate that DBS may represent a viable alternative to plasma for antiretroviral resistance testing in treated and untreated subjects.	pt_BR
dc.degree.country	Brasil	pt_BR
dc.description.sponsordocumentnumber	n/a	pt_BR
dc.description.abstractpt	Os testes de resistência aos fármacos do HIV-1 (HIVDR) são ferramentas importantes no tratamento clínico de pacientes infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral (TARVc) e vigilância de variantes resistentes aos fármacos em níveis populacionais. Normalmente este teste é realizado utilizando amostras de plasma, que necessita de transporte de frio para ser transportado de locais de coletas distantes para os laboratórios, mas recentemente tem sido utilizadas amostras de sangue total aplicadas em papel de filtro seco (DBS - Dry Blood Spots), sendo uma forma alternativa de coleta, que não precisa da cadeia de frio e que pode ser transportado e mantido em um período de até 14 dias a temperatura ambiente, e, é uma alternativa conveniente ao plasma para testes de resistência aos antirretrovirais em locais de recursos limitados. O presente estudo tem como objetivo comparar os resultados obtidos do teste de genotipagem de desenvolvimento próprio (“in house”) do HIV-1 através do plasma, considerado o “gold-standard’, com os obtidos através de amostras de DBS. Foi investigada a correlação entre os resultados de resistência gerados a partir de DBS e plasma. Um total de 102 amostras foram coletadas para o estudo. Vinte e seis amostras foram excluídas em razão do valor da carga viral ser inferior a 1.000 cópias/mL e 76 amostras foram sequenciadas para a resistência a TARVc em amostras de plasma, incluindo espécimes de pacientes em tratamento (n = 62) e naïves (n = 14). As amostras de DBS foram preparadas utilizando 100μL de sangue total e foram armazenados com dessecante a -70 ºC. Dentre as 76 amostras cujas variantes virais obtidas de plasma que foram sequenciadas, foi possível obter a amplificação e o sequenciamento de 42 amostras aplicadas em DBS que apresentaram carga viral plasmática superior a 3.000 cópias/mL. Para a extração do RNA viral, foram utilizadas duas técnicas diferentes, através do sistema NucliSENS® miniMag®, com rendimento baixo (13/57 – 22,8%), e com o QIAamp viral RNA minikit, que apresentou rendimento (33/51 – 64,7%) do RNA extraído comparável às amostras de plasma. Houve concordância de 100% na determinação do subtipo genético e 97,7% de sucesso na comparação das mutações encontradas entre as duas matrizes. Foi demonstrado haver uma alta concordância entre os resultados do sequenciamento oriundo de amostras de plasma e de DBS, tanto para a identificação do subtipo viral, como para a determinação das mutações associadas a diminuição da susceptibilidade aos antirretrovirais. Estes resultados indicam que o DBS pode representar uma alternativa viável ao plasma para testes de resistência aos antirretrovirais em indivíduos tratados e não tratados.	pt_BR
dc.subject.pt	DBS – dry blood spots	pt_BR
dc.subject.pt	HIV-1	pt_BR
dc.subject.pt	Genotipagem	pt_BR