A influência do plasma rico em plaquetas no isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais estromais da medula-óssea

Macedo, Camila Grohs

DSpace Home
→
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS)
→
Biomedicina
→
BIOM - Trabalhos de Conclusão de Curso - Graduação
→
View Item

dc.contributor.advisor	Souza, Alex Balduino de
dc.contributor.author	Macedo, Camila Grohs
dc.date.accessioned	2018-12-06T15:58:55Z
dc.date.available	2018-12-06T15:58:55Z
dc.date.issued	2016-07-22
dc.identifier.citation	MACEDO, Camila Grohs. A influência do plasma rico em plaquetas no isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais estromais da medula-óssea. 2016. 72 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Instituto Biomédico, Rio de Janeiro, 2016.	pt_BR
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/unirio/12618
dc.description.sponsorship	n/a	pt_BR
dc.language.iso	Portuguese	pt_BR
dc.rights	openAccess	pt_BR
dc.title	A influência do plasma rico em plaquetas no isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais estromais da medula-óssea	pt_BR
dc.type	bachelorThesis	pt_BR
dc.contributor.referee	Costa, Patrícia Cristina dos Santos
dc.contributor.referee	Malaquias, Angelo Telesforo
dc.contributor.referee	Ocampo, Jurandy Susana Patricia Morales
dc.contributor.referee	Souza, Alex Balduino de
dc.degree.department	CCBS-Instituto Biomédico	pt_BR
dc.degree.grantor	Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO	pt_BR
dc.degree.level	Graduação	pt_BR
dc.degree.local	Rio de Janeiro, RJ	pt_BR
dc.degree.program	Bacharelado em Biomedicina-CCBS	pt_BR
dc.subject.cnpq	Outros	pt_BR
dc.subject.cnpq	Biomedicina	pt_BR
dc.subject.en	Bone Marrow	pt_BR
dc.subject.en	Stem Cells	pt_BR
dc.subject.en	In Vitro Techniques	pt_BR
dc.subject.en	Platelet-Rich Plasma	pt_BR
dc.description.abstracten	The bone marrow composes one of the most important organs in postnatal life, due to its essential functions in the homeostasis of the human organism. Two lineages coexist and interact in the endosteal niche, they are Hematopoietic Stem Cell (HSC) and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell (BM-MSC). The HSC are hematopoietic progenitors that will give rise to all blood cell lineages, which includes lymphoid progenitors, myeloid progenitors and consequently platelets. The BMSC are originated from intermediary germ layer, the mesoderm. In the bone marrow, these cells are part of the marrow stroma, where they are denominated reticular stromal cells, thus acting directly to support the hematopoiesis. In situ, they are responsible for the continuous process of repairing and regenerating the cells of the connective tissue which forms the marrow, such as osteoblasts (bones), chondrocytes (cartilage), adipocytes (fat), fibroblasts (tendon and ligament), myoblasts (muscle) and marrow stroma. In that way, the differentiation in mesenchymal lineages is innate to BMSC, although they can still be induced to suffer cell transdifferentiation, such in vitro as in vivo.Therefore, Mesenchymal cells can yet give rise to hepatocytes, B-pancreatic cells, kidney cells, cornea cells, cardiomyocytes and even myelinated neurons. Giving emphasis to other major characteristics of the BMSC, they have the ability to migrate to the site of the lesion, and at the site of injury, they secrete immunomodulatory factors, which will act adjusting the local inflammation and later the secretion of trophic factors will promote the regeneration of the tissue. Due to all these advantages, the mesenchymal cells are extremely relevant to the treatment of many serious pathological conditions that are potentially reversible with the use of autologous cell therapy. But, since the concentration of mesenchymal stromal cells in fresh samples of marrow is very low, they are not enough for immediate transplant, which requiresexpansion in-vitro. Nowadays, the isolation and expansion protocol of BMSC, called Colony Forming Units in-vitro, is extensively reproduced around the world. Nevertheless, the addition of Fetal Bovine Serum (SFB), universally used in cell culture as exogenous growth factors, in despite of being influent in the proliferation of the BMSC, it causes the treatment to be xenophobic, as the cells that are cultivated under the influence of SFB are rejected by the human organism. So, because of the cons caused by the use of SFB in cultures, this study suggests as an alternate idea of exogenous growth factors the use of platelets rich plasma (PRP), in order to verify the influence in adherence and proliferation of the BMSC in-vitro. The PRP composes pellet of platelets, diluted in a minimum concentration of platelet-poor plasma (PPP), formed basically by serum, both coming from the peripheral blood. When 10 interacting with the cells in culture, platelet lysis culminates in the liberation of many growth factors, which is directly related to the adherence and proliferation of the BMSC in-vitro. The samples were obtained by scraping the medullary acetabulum of adult patients (men and women) with medical indication to the implant of hipbone prosthesis, where the material that would be discarded after the surgery was collected by our group to create the possibility of isolation and expansion (proliferation) of the mesenchymal stromal cells (based on the adherence of UFC-Fin-vitro). The cells were plated in their own initial density (4x104) and (8x104) and then added PRP 1%, PRP 2,5% and PRP 5%, maintaining the SBF 10% as control, verifying after 14 days its influence on adherence and proliferative activity of the BMSC in culture. Therefore, it was observed that even in low concentrations, the PRP shows a significant interference in the number of obtained colonies, alsoin their size. Thus, the treatment of the “control group” (SBF 10%) resulted in adherence and proliferation rates similar to the ones obtained with the PRP 1%. As we increase the concentration of PRP added to the culture, we also increase the obtained rates. In consequence of that, the results acquired with PRP 2,5% and PRP 5% were considerably higher than SFB 10%, regarding the influence on isolation and on expansion of the BMSC. Therefore, a much smaller concentration of PRP is enough to activate the potentials of the BMSC, and besides obtaining more colonies, these present larger areas when compared to colonies cultured in SFB. The colonies plated under the influence of PRP, display yet a discretely distinct morphology from the cells that were observed with the animal serum, being larger than the cells that were obtained with the serum. In this way, the PRP 2,5% demonstrated a bigger colony forming efficiency, where the colonies obtained are larger and denser. Now, the PRP 5% displayed a significant enlargement of these rates, in which due to the high concentration of the formed colonies and the high rate of their proliferation, in the 12th day of culture these cells had already been in subconfluency. Thus, this study proposes that the platelet-rich plasma can be used in BMSC cultures, intending to substitute the use of SFB in human cell cultures, having that the platelets do accomplish a significant influence in the adherence of the UFC-F and also in the proliferative activity of the formed colonies.	pt_BR
dc.description.sponsordocumentnumber	n/a	pt_BR
dc.description.abstractpt	A medula óssea constituí um dos orgãos mais importantes na vida de pós-natos, pois realiza funções essênciais para a homeostase do organismo humano. Destacamos então duas linhagens que coexistem e interagem no nicho endosteal, são elas as células-tronco hematopoiéticas (HSC) e as células-tronco mesenquimais estromais (do inglês Bone marrow Mesenchymal Stroma Cell –BMSC). As HSC são progenitores hematopoiéticos que vão dar origem a toda linhagem de células sanguíneas, o que incluí progenitores linfóides, mielóides e consequentemente as plaquetas. Já as BMSC são derivadas da camada intermédia geeminativa: o mesoderma. Na medula óssea, essas células fazem parte do estroma medular, onde são denominadas de células reticulares do estroma, que por sua vez tem ação direta de suporte à hematopoiese. In-situ, são responsáveis pelo processo contínuo de reparo e regeneração de células dos tecidos conjuntivos constituintes da medula, tais quais: osteoblastos (osso), condroblastos (cartilagem), adipócitos (gordura), fibroblastos e estroma medular. Dessa forma, a diferenciação em linhagens mesênquimais é inata às BMSC, contudo elas ainda podem ser induzidas à sofrer transdiferenciação, tanto in vitro quanto in vivo, o que caracteriza que as células mesenquimatosas podem ainda dar origem a hepatócitos, células ß-pancreáticas, células renais, células da córnea, cardiomiócitos e até mesmo em neurônios mielinizados. Destacamos ainda outras características muito importantes das BMSC como a capacidade de migrar até o site de lesão, e no local de injúria, elas secretam fatores imunomodulatórios, que vão agir regulando a inflamação local e posteriormente a secreção de fatores tróficos promovem a regeneração do tecido. Devido a todas essas vantagens, as células mesênquimais são de extrema relevância para o tratamento de diversas condições patológicas graves, que são potencialmente reversíveis com o uso de terapia celular autóloga. Porém, devido à baixa concentração das células estromais mesenquimais na medula fresca, elas são insuficientes para transplante imediato e por isso, a expansão das mesmas in vitro torna-se essêncial. Atualmente o protocolo de isolamento e expansão das BMSC, denominadas unidades formadoras de colônias in vitro é amplamente reproduzido ao redor do mundo. No entanto a adição do soro fetal bovino (SFB), universalmente utilizado em cultura de células como fonte exógena de fatores de crescimento, apesar de ser influente na atividade proliferativa das BMSC, torna o tratamento xenófobo, ou seja, as células cultivadas sob influência de SFB são rejeitadas pelo organismo humano. Portanto devido as contraindicações acarretadas com o uso do SFB em cultura, nosso estudo sugere como fonte alternativa de fatores de crescimento exógeno o uso do plasma rico em plaquetas (PRP), afim 7 de verificar sua influência sobre o potencial de aderência e proliferação das BMSC in vitro. O PRP constituí um concentrado de plaquetas, diluídas em uma mínima quantidade de plasma pobre em plaquetas (PPP), constituído basicamente por soro, ambos obtidos à partir do sangue periférico. Ao interagir com as células em cultura, a lise das plaquetas culmina na liberação de vários fatores de crescimento, o que tem papel direto na adesão e na proliferação das BMSC in vitro. As amostras de BMSC foram obtidas à partir de raspado medular do acetábulo ilíaco de pacientes adultos (homens e mulheres) com indicação clínica para o implante de prótese de quadril, onde este material que seria descartado após a cirurgia, foi coletado por nossa equipe, para que fosse possível o isolamento (baseado na aderência de UFC-F in vitro) e expansão (proliferação) das células mesenquimais estromais in vitro. As células foram cultivadas em suas densidades iniciais [4x104] e [8x104] e então foram suplementares com PRP 1% ; PRP 2,5% e PRP 5%, mantendo o SFB 10% como controle, verificando-se após quatorze dias, a influência dos mesmos sob a aderência e proliferação das BMSC em cultura. Logo foi observado que mesmo em baixas concentrações, o PRP demonstra interferência significativa no número de colônias obtidas, assim como no tamanho das mesmas. Dessa forma o tratamento do grupo controle (SFB 10%) apresentou taxas de adesão e atividade proliferativa próximas as obtidas com o PRP 1%. Conforme aumentamos a concentração de PRP adicionado ao meio de cultura, aumentamos também as taxas obtidas. Assim, os resultados adquiridos com PRP 2,5% e PRP 5% foram consideravelmente superiores ao SFB10% quanto a influência no isolamento e na expansão das BMSC. Tendo em vista que uma concentração muito menor de PRP já é o suficiente para ativar os pontenciais proliferativos desempenhados pelas BMSC, sendo que com o PRP, além de obtermos mais colônias, essas apresentam áreas maiores quando comparadas com o SFB. As coĺônias cultivadas sob influência de PRP, apresentam ainda uma morfologia discretamente distinta das células observadas com o soro animal, sendo células maiores do que as obtidas com o soro. Dessa forma o PRP 2,5% demonstrou maior eficiência de formação de colônia, onde as coĺônias obtidas são maiores e mais densas. Já o PRP 5% apresentou uma amplificação significativa nessas taxas, onde devido a alta concentração de colônias formadas e alta taxa de proliferação das mesmas, ao décimo segundo dia de cultura essas células já se encontravam em subconfluência. Dessa forma nosso estudo propõe que o plasma rico em plaquetas pode ser utilizado em cultura de BMSC, visando substituir a utilização do soro fetal bovino em culturas de células humanas, visto que as plaquetas realizam influência significativa na aderência das UFC-F e ainda na atividade proliferativa das colônias formadas.	pt_BR
dc.subject.pt	Medula Óssea	pt_BR
dc.subject.pt	Células-Tronco	pt_BR
dc.subject.pt	Técnicas In Vitro	pt_BR
dc.subject.pt	Plasma Rico em Plaquetas	pt_BR