Avaliação de protocolos de extração, purificação e PCR de DNA de fezes humanas para estudo de microbioma

Silva, Ygor Parladore

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Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS)
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BIOM - Trabalhos de Conclusão de Curso - Graduação
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dc.contributor.advisor	Nogueira, Eduardo de Matos
dc.contributor.author	Silva, Ygor Parladore
dc.date.accessioned	2019-03-28T19:24:31Z
dc.date.available	2019-03-28T19:24:31Z
dc.date.issued	2018-12-10
dc.identifier.citation	SILVA, Ygor Parladore. Avaliação de protocolos de extração, purificação e PCR de DNA de fezes humanas para estudo de microbioma. 2018. 52 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Instituto Biomédico, Rio de Janeiro, 2018.	pt_BR
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/unirio/12719
dc.description.sponsorship	n/a	pt_BR
dc.language.iso	Portuguese	pt_BR
dc.rights	openAccess	pt_BR
dc.title	Avaliação de protocolos de extração, purificação e PCR de DNA de fezes humanas para estudo de microbioma	pt_BR
dc.title.alternative	Evaluation of extraction, purification and PCR protocols of human stool DNA for microbiome study	pt_BR
dc.type	bachelorThesis	pt_BR
dc.contributor.referee	Nogueira, Eduardo de Matos
dc.contributor.referee	Fonseca, Adenilson de Souza da
dc.contributor.referee	Albano, Rodolpho Mattos
dc.degree.department	CCBS-Instituto Biomédico	pt_BR
dc.degree.grantor	Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO	pt_BR
dc.degree.level	Graduação	pt_BR
dc.degree.local	Rio de Janeiro, RJ	pt_BR
dc.degree.program	Bacharelado em Biomedicina-CCBS	pt_BR
dc.subject.cnpq	Outros	pt_BR
dc.subject.cnpq	Biomedicina	pt_BR
dc.subject.en	Metagenomics	pt_BR
dc.subject.en	DNA extraction	pt_BR
dc.subject.en	DNA purification	pt_BR
dc.subject.en	Polymerase Chain Reaction	pt_BR
dc.subject.en	Intestinal microbiota	pt_BR
dc.description.abstracten	Growing evidence shows that the microbiota plays vital roles in health. The main form of studying it is by metagenomics, which is sequencing of the bacterial community, analysis of its profile and association with health and disease conditions. Current sequencing technologies have great throughput, but procedures for conducting such research are not fully standardized, such as study design, DNA extraction method, library assembly and bioinformatics analysis. Therefore, the aim of this work was to standardize a protocol with the best cost-benefit for future studies of the human intestinal microbiota in the UNIRIO Genomics Laboratory. Stool samples from a healthy person from the lab were collected for evaluation of DNA extraction methods and kits for purification and PCR. The extraction methods tested were Zoetendal’s (2006), by mechanical cell lysis, and Doyle and Doyle’s (1987), by chemical cell lysis, both with adaptations. Three DNA purification kits were evaluated, two employing magnetic immobilization and one employing membrane filtration. These were used alone or in combination, in a total of 7 different protocols. Three PCR kits were tested for amplification of the 16S rRNA encoding gene V4 region with primers designed for the Illumina platform sequencing. Both extraction methods were efficient in isolating whole genomic DNA from fecal samples and could be adapted for use in large volumes. This adaptation allows obtaining more representative samples of the microbiota and generating a larger mass of DNA for later analysis. From the purification protocols evaluated, all maintained the genomic DNA, but most presented mass loss. However, the efficiency parameter of purification in the laboratory is viability of the DNA solution for PCR. In this case the most efficient protocol was the ProNex Size-Selective Purification System (Promega) kit done twice in a row. Although it was also the most expensive protocol, it generated higher number of positive PCRs. Likewise, the Doyle & Doyle method was the one that had the most viable DNA extracts for PCR. The most cost-effective PCR kit was the GoTaq G2 Hot Start Colorless (Promega), which not only presented higher efficiency in the amplification of the purified DNA samples, but also had the lowest cost among the kits tested. The differential characteristics of the kit are its higher concentration of MgCl2+ and the use of hot-start Taq enzyme.	pt_BR
dc.description.sponsordocumentnumber	n/a	pt_BR
dc.description.abstractpt	Crescentes evidências mostram que a microbiota desempenha funções vitais para a saúde. Sua principal forma de estudo é pela metagenômica, ou seja, sequenciamento da comunidade bacteriana, análise de seu perfil e associação com condições de saúde e doença. Tecnologias atuais de sequenciamento possuem grande processividade, porém procedimentos para realização de tais pesquisas estão pouco padronizados, como desenho de estudo, método de extração de DNA, montagem de bibliotecas e análise bioinformática. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi padronizar um protocolo com melhor custo-benefício para futuros estudos da microbiota intestinal humana no Laboratório de Genômica da UNIRIO. Amostras de fezes de uma pessoa saudável da equipe foram coletadas para avaliação de métodos de extração de DNA e kits de purificação e PCR. Os métodos de extração testados foram de Zoetendal (2006), por lise celular mecânica, e de Doyle e Doyle (1987), por lise celular química, ambos com adaptações. Foram testados três kits de purificação de DNA, dois que empregam imobilização magnética e um de filtração por membrana. Estes foram usados isoladamente ou combinados entre si, em um total de 7 protocolos diferentes. Três kits de PCR foram testados para amplificação da região V4 do gene codificador de rRNA 16S com oligonucleotídeos desenhados para sequenciamento de plataforma Illumina. Ambos os métodos de extração foram eficientes em isolar DNA genômico íntegro das amostras de fezes e puderam ser adaptados para uso de grandes volumes. Essa adaptação permite obtenção de amostras mais representativas da microbiota e geração de maior massa de DNA para análises posteriores. Todos os protocolos de purificação testados mantiveram o DNA genômico, porém a maioria apresentou perda de massa. No entanto, o parâmetro de eficiência da purificação no laboratório é a viabilidade da solução de DNA para PCR. O protocolo mais eficiente foi o do kit ProNex Size-Selective Purification System (Promega) feito duas vezes. Apesar de ser o protocolo mais caro, foi o que gerou maior número de PCRs positivas. Da mesma forma, o método CTAB foi o que gerou mais extratos de DNA que funcionaram na PCR. O kit de PCR com melhor custo-benefício foi o GoTaq G2 Hot Start Colorless (Promega), que não só apresentou maior eficiência na amplificação das amostras de DNA purificadas, como também possui o menor custo dentre os kits testados. As características diferenciais do kit são sua maior concentração de MgCl2+ e o uso de enzima Taq hot-start.	pt_BR
dc.subject.pt	Metagenômica	pt_BR
dc.subject.pt	Extração de DNA	pt_BR
dc.subject.pt	Purificação de DNA	pt_BR
dc.subject.pt	Reação em Cadeia da Polimerase	pt_BR
dc.subject.pt	Microbiota intestinal	pt_BR