Estudo molecular do gene FGFR3: rastreamento de mutações pela técnica de genotipagem por High Resolution Melt (HRM)

Riba, Fernanda Rolemberg Gonçalves

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dc.contributor.advisor	Mencalha, Andre Luiz
dc.contributor.author	Riba, Fernanda Rolemberg Gonçalves
dc.date.accessioned	2020-01-30T16:26:09Z
dc.date.available	2020-01-30T16:26:09Z
dc.date.issued	2019-02-26
dc.identifier.citation	RIBA, Fernanda Rolemberg Gonçalves. Estudo molecular do gene FGFR3: rastreamento de mutações pela técnica de genotipagem por High Resolution Melt (HRM). 2019. 82 f. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular) - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2019.	pt_BR
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/unirio/13061
dc.description.sponsorship	n/a	pt_BR
dc.language.iso	Portuguese	pt_BR
dc.rights	openAccess	pt_BR
dc.title	Estudo molecular do gene FGFR3: rastreamento de mutações pela técnica de genotipagem por High Resolution Melt (HRM)	pt_BR
dc.title.alternative	Molecular study of FGFR3 gene: screening of mutations in the High Resolution Melt (HRM) genotyping assay	pt_BR
dc.type	masterThesis	pt_BR
dc.contributor.advisor-co	Gonzalez, Sayonara Maria de Carvalho
dc.contributor.referee	Mencalha, Andre Luiz
dc.contributor.referee	Paiva, Carmen Lucia Antão
dc.contributor.referee	Lima, Carlos Fernando Araujo
dc.contributor.referee	El-Jaicki, Kênia Balb
dc.contributor.referee	Simão, Tatiana de Almeida
dc.contributor.referee	Gomes, Leonardo Henrique Ferreira
dc.degree.department	CCBS	pt_BR
dc.degree.grantor	Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO	pt_BR
dc.degree.level	Mestrado Acadêmico	pt_BR
dc.degree.local	Rio de Janeiro, RJ	pt_BR
dc.degree.program	Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular	pt_BR
dc.subject.cnpq	CIÊNCIAS BIOLÓGICAS	pt_BR
dc.subject.cnpq	BIOQUÍMICA	pt_BR
dc.subject.cnpq	BIOLOGIA MOLECULAR	pt_BR
dc.subject.en	Skeletal dysplasia	pt_BR
dc.subject.en	FGFR3	pt_BR
dc.subject.en	HRM	pt_BR
dc.description.abstracten	The FGFR3 gene is a fibroblast growth factor receptors (FGFR) tyrosine kinase type, that plays an important role in bone development, acting as a negative modulator tothe growth plate. Mutations in this gene has been related with some types of skeletal dysplasias, which stand out acondroplasia (ACH), hypocondroplasia (HCH) and thanatoforic dysplasia type I and II (TDI and TDII respectively). Although sequencing is an accurate technique for identifying mutations, the HRM technique is an economically more accessible and faster strategy. This research aimed to trace mutations in FGFR3 gene in patients forwarded by medical genetics department the of Instituto Fernandes Figueira/IFF - Fiocruz with features consistent with skeletal dysplasia (SD) related to this gene and standardize and to implant the HRM technique as a genotyping method for these SDs. For the analysis of genetic alterations, DNA samples from patients were obtained from peripheral blood or umbilical cord blood. Specific regions of the FGFR3 gene were amplified by PCR, to be sequenced by Sanger method. The results were submitted to sequence alignment with the Align software (Scientific & Educational Software 3.0 version), to verify the similarities between the sequences obtained and the FGFR3 gene reference sequence. For HRM genotyping, the MeltDoctor HRM Master Mix Kit was used. The PCR products were subjected to an increasing temperature gradient in the presence of a double-stranded DNA intercalating and the comparison of the melting curve of each patient in relation to a control DNA was performed on the equipment 7500 FAST Real time System. In this research, we reported sixty-one cases of patients clinically diagnosed with SD related to the FGFR3 gene. Thirty patients with ACH presented the mutation g.16081 G> A, three presented the mutation g.16081 G> C, mutations known for its relation with ACH, and three patients presented negative results. Subsequently, a new clinical review excluded the possibility of this diagnosis for these patients. Among fifteen HCH patients, five showed the g.17333 C>A mutation, five showed the g.17333 C>G mutation and five others were negative for known mutations related to this SD. A new clinical review of these cases excluded the possibility of this diagnosis, reinforcing the results obtained by molecular analysis. Among the ten patients with TD, six presented a g.13526 C>T mutation related to TDI, two patients with phenotype typical for TDI presented negative results and new alteration are being investigated, and two patients presented the g.17852 A>G mutation related to TDII. These patients with the already discriminated mutations were used as positive control for the standardization of the HRM technique. The patients who presented positive results confirmed the molecular etiology associated with clinical diagnosis and the HRM technique proved to be eficiente to discriminate the types of SDs.	pt_BR
dc.degree.country	Brasil	pt_BR
dc.description.sponsordocumentnumber	n/a	pt_BR
dc.description.abstractpt	O gene FGFR3 é um receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR), do tipo tirosina cinase, que desempenha um papel importante no desenvolvimento ósseo, atuando como um modulador negativo na placa de crescimento. Mutações neste gene são relacionadas a alguns tipos de displasias esqueléticas (DEs), como acondroplasia (ACH), hipocondroplasia (HCH) e displasia tanatofórica tipos I e II (DTI e DTII respectivamente). Embora o sequenciamento seja uma técnica precisa para a identificação de mutações, a técnica de HRM é uma estratégia economicamente mais acessível e rápida. Este trabalho teve como objetivo identificar mutações no gene FGFR3 de pacientes encaminhados pelo Departamento de Genética Médica do Instituto Fernandes Figueira/IFF - Fiocruz com características compatíveis com displasias esqueléticas (DEs) relacionadas a esse gene e padronizar e implantar a técnica de HRM como um método de genotipagem para estas DEs. Para análise das alterações genéticas, amostras de DNA de pacientes foram obtidas a partir de sangue periférico ou de sangue de cordão umbilical. Regiões específicas do gene FGFR3 foram amplificadas pela técnica de PCR, para serem sequenciados pelo método de Sanger. Os resultados foram submetidos ao alinhamento de sequências com o auxílio do programa Align (Scientific & Educational Software versão 3.0), para a verificação das similaridades entre as sequências obtidas e a sequência de referência do gene FGFR3. Para a genotipagem por HRM, utilizou-se o Kit MeltDoctor HRM Master Mix. Os produtos da PCR foram submetidos a um gradiente crescente de temperatura em presença de um intercalante de DNA dupla-fita e a comparação da curva de fusão de cada paciente em relação a um DNA controle foi realizada no aparelho 7500 FAST Real time System. Neste estudo, relatamos sessenta e um casos de pacientes diagnosticados clinicamente com DEs relacionadas ao gene FGFR3. Trinta pacientes com ACH apresentaram a mutação g.16081 G>A, três apresentaram a mutação g.16081 G>C, já conhecidas por sua relação com ACH, e três pacientes apresentaram resultado negativo. Posteriormente, uma revisão clínica excluiu a possibilidade desse diagnóstico para estes pacientes. Dos quinze pacientes com HCH, cinco apresentaram a mutação g.17333 C>A, cinco apresentaram a mutação g.17333 C>G e os outros cinco apresentaram resultado negativo para as mutações relacionadas a essa DE. Uma revisão clínica desses casos excluiu a possibilidade desse diagnóstico, reforçando o resultado obtido pela análise molecular. Dentre os dez pacientes com DT, seis apresentaram a mutação g.13526 C>T relacionada à DTI, dois pacientes com fenótipo típico para DTI apresentaram resultado negativo e novas alterações estão sendo investigadas, e dois pacientes apresentaram a mutação g.17852 A>G relacionada à DTII. Os pacientes com as mutações já discriminadas foram utilizados como controle positivo para a padronização da técnica de HRM. Os pacientes que apresentaram resultado positivo confirmaram a etiologia molecular associada ao diagnóstico clínico e a técnica de HRM mostrou-se eficiente para discriminar os tipos de DEs.	pt_BR
dc.subject.pt	Displasia esquelética	pt_BR
dc.subject.pt	FGFR3	pt_BR
dc.subject.pt	HRM	pt_BR